Monocyty krwi obwodowej - apoptoza po fagocytozie bakterii oraz zmiany funkcjonalne w następstwie kontaktu z ...
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Monocyty krwi obwodowej – apoptoza po fagocytozie bakterii oraz
zmiany funkcjonalne w nast
ę
pstwie kontaktu z komórkami
apoptotycznymi
Prof. dr hab. Juliusz Pryjma, Instytut Biologii Molekularnej Uniwersytetu
Jagiello
ń
skiego, Kraków
Układ odporności organizmów wyŜszych wykształcił się w przebiegu ewolucji
jako mechanizm obrony przed zakaŜeniami przez patogeny (wirusy, bakterie, grzyby
i pasoŜyty). Zadanie to jest realizowane przez system odporności wrodzonej –
nieswoistej, lecz zdolnej do rozpoznania patogenu i powstrzymania jego rozwoju w
komórkach i narządach gospodarza oraz przez system odporności swoistej dla
danego patogenu nabywanej w następstwie zakaŜenia i najczęściej zdolnej do
całkowitej eliminacji patogenu. Do mechanizmów nieswoistych zaliczamy przede
wszystkim komórki fagocytujące (makrofagi, granulocyty obojętnochłonne
i monocyty), układ dopełniacza oraz szereg mediatorów – cytokin, chemokin,
produktów przemiany kwasu arachidonowego itp., które nawet przy pierwszym
kontakcie z patogenem są w stanie uruchomić odpowiedź zapalną, w celu
ograniczenia i powstrzymania infekcji. Mechanizmy swoiste są wynikiem selekcji oraz
rozwoju klonów limfocytów B i T, zdolnych odpowiednio do rozpoznania antygenów
patogenu lub tworzących je peptydów prezentowanych limfocytom przez tzw.
komórki prezentujące, zwłaszcza komórki dendrytyczne. Wynikiem rozwoju
odpowiedzi swoistej jest powstawanie przeciwciał oraz efektorowych limfocytów T –
cytotoksycznych (CD8+) oraz CD4+, zdolnych do aktywowania komórek
fagocytujących lub nawet cytotoksyczności (TH1), lub z dominującą zdolnością do
aktywowania limfocytów B produkujących przeciwciała (TH2). Badania ostatnich lat
wyraźnie pokazują, Ŝe chociaŜ odpowiedź swoista jest zazwyczaj niezbędna do
całkowitej eliminacji patogenu, to jednak jej powstanie i skuteczność są
zdeterminowane przez mechanizmy nieswoiste, w tym zwłaszcza tzw. komórki
dendrytyczne, prezentujące limfocytom T antygeny patogenów.
Monocyty krwi obwodowej stanowią populację komórek o istotnym znaczeniu
zarówno dla odporności nieswoistej (wrodzonej), jak i swoistej (nabytej). Stanowią 2-
4% ogółu leukocytów i chociaŜ od co najmniej 30-tu lat bardzo często są
wykorzystywane w prowadzonej
in vitro
diagnostyce układu odporności człowieka,
jednak jak dotąd zazwyczaj zainteresowanie nimi miało głównie charakter
drugoplanowy. W badaniach reaktywności limfocytów monocyty stanowiły źródło
komórek prezentujących antygen lub komórek wspomagających odpowiedź na
niektóre mitogeny. Były takŜe traktowane jako łatwo dostępny substytut makrofagów
ludzkich.
Monocyty są heterogenną populacją komórek, które z jednej strony stanowią stadium
przejściowe makrofagów tkankowych oraz części komórek dendrytycznych
a z drugiej same uczestniczą w odpowiedzi układu odporności. Migrując do miejsc
toczącego się stanu zapalnego, stanowią drugą po granulocytach populację komórek
napływowych, zdolnych nie tylko do fagocytozy oraz zabijania drobnoustrojów, ale
takŜe do prezentacji antygenu pamięciowym limfocytom T. W krąŜeniu są
prawdopodobnie pierwszą populacją komórek reagujących na dysfunkcję śródbłonka
i naciekającą ścianę naczynia w procesach prowadzących do powstania blaszki
miaŜdŜycowej. Stanowią wreszcie główną populację komórek produkujących
cytokiny w czasie posocznicy.
Aby przedstawić spójny obraz prowadzonych w moim zespole badań
monocytów skoncentruję się na tych wynikach, które doprowadziły do opisania przez
nas apoptozy monocytów krwi obwodowej w następstwie fagocytozy bakterii
zewnątrzkomórkowych, a takŜe konsekwencji, jakie apoptoza monocytów (jak
równieŜ neutrofilów) moŜe mieć na regulację nieswoistej i swoistej odpowiedzi układu
odporności.
„Wszechstronno
ść
” monocytów ?
Punktem wyjścia naszych badań było postawione przez nas 10 lat temu
pytanie o wzajemny wpływ rozmaitych funkcji monocytów na wydolność tych
komórek – np. czy monocyt wypełniając jedną funkcję moŜe następnie wykonać inną
oraz czy wykonując ją będzie bardziej czy teŜ mniej sprawny. Pytaliśmy czy monocyt,
będąc komórką zdolną do prezentacji antygenu oraz do fagocytozy i zabijania
drobnoustrojów, moŜe te funkcje wykonać jedna po drugiej – np. sfagocytować
i zabić bakterie a następnie skutecznie zaprezentować antygen. W tym celu
inkubowaliśmy monocyty z Ŝywymi bakteriami opsonizowanymi surowicą ludzką,
a następnie dodawaliśmy antygen oraz autologiczne limfocyty i ocenialiśmy
odpowiedź na antygen, mierząc proliferację limfocytów T i/lub produkcję interferonu
gamma (INF
g
). Okazało się, Ŝe monocyty, które sfagocytowały i zabiły bakterie nie
były zdolne do prezentacji antygenu.
Równoległe badania pokazały, Ŝe monocyty, które prezentują antygen
pamięciowym limfocytom T CD4+, ulegają apoptozie jak moŜna było wnosić na
podstawie obecności w jądrach monocytów, prezentujących antygen pęknięć DNA
wykrytych metodą TUNEL (
T
erminal deoxynucleotidyl Transferaze Biotin-d
U
TP
N
ick
E
nd
L
abeling)
.
Podsumowując, uzyskane wyniki wskazały, Ŝe monocyty są komórkami, które
mogą niektóre funkcje wypełniać tylko jednorazowo.
Obserwując utratę zdolności monocytów do prezentacji antygenu
w następstwie fagocytozy bakterii zauwaŜyliśmy zmiany morfologiczne monocytów,
sugerujące ich apoptozę. PoniewaŜ w tym czasie w piśmiennictwie opisana była
jedynie apoptoza komórek linii J774 zakaŜonej pałeczkami
Shigella
wiele czasu
i energii poświęciliśmy wykazaniu oraz zbadaniu mechanizmu apoptozy monocytów
po fagocytozie bakterii.
Termin
„apoptosis”
jest uŜywany do określenia rodzaju śmierci komórki,
w tym równieŜ śmierci programowanej, wspólnego dla wielu typów komórek, często
związanego z czynnikami stymulującymi i prowadzącymi do określonych zmian
morfologicznych komórki. W procesie tym kaskada swoistych reakcji biochemicznych
wiedzie do kondensacji chromatyny jądra i cytoplazmy, aktywacji endonukleaz
komórkowych i w konsekwencji do degradacji własnego DNA. Degradacja DNA
przebiega w dwóch etapach, najpierw na duŜe fragmenty (300.000-50.000 par
zasad), a następnie na oligonukleosomy o długości ok. 180-200 par zasad.
W przeciwieństwie do martwicy (nekrozy), dla której typowy jest obrzęk organelli
cytoplazmatycznych z następowym rozpadem komórek (co wiedzie do odczynu
zapalnego), apoptoza nie prowadzi do reakcji zapalnej, nie dochodzi bowiem do
uszkodzenia błony komórkowej i uwolnienia do otoczenia zawartości komórek.
Komórki rozpadają się na tzw. „ciałka apoptotyczne”, które składają się z fragmentów
komórki otoczonych błoną komórkową i są rozpoznawane za pomocą wielu typów
receptorów (np. CR3, CR4, witronektynowych, fosfatydyloserynowych,
trombospondynowych, CD14) przez makrofagi oraz inne komórki i są następnie
fagocytowane i degradowane. Apoptoza jest więc procesem, w którym umierająca
Apoptoza
komórka aktywnie uczestniczy w „samodestrukcji”, uwalniając kaskadę
charakterystycznych mechanizmów metabolicznych, kończących się fizyczną
dezintegracją komórki.
Biorąc pod uwagę mnogość czynników endogennych i środowiskowych
mogących prowadzić do apoptozy róŜnych typów komórek (np. związanie receptorów
powierzchniowych, uszkodzenie DNA za pomocą leków lub promieniowania
jonizującego, niedobór czynników wzrostowych, działanie cytokin, infekcje bakteryjne
i wirusowe), uwaŜa się, iŜ apoptoza moŜe zachodzić na dwóch centralnych szlakach:
zewnętrznym, zwiazanym z istnieniem błonowych receptorów śmierci oraz
wewnętrznym, zwanym równieŜ mitochondrialnym. NiezaleŜnie od źródła sygnału
inicjującego, proces apoptozy jest drobiazgowo regulowany i wymaga współdziałania
szeregu elementów, prowadząc do powstania swoistej kaskady reakcji
biochemicznych. W rezultacie dochodzi do aktywacji kaspaz i proteolitycznej
degradacji DNA komórki.
Kaspazy
(ang.
caspases -
c
ysteine-dependent
asp
artate-specific prote
ases
)
to enzymy z grupy proteaz cysteinowych rozszczepiające polipeptydy po reszcie
kwasu asparaginowego. Do chwili obecnej u ssaków opisano 14 róŜnych kaspaz.
W komórce są syntetyzowane w formie nieaktywnych zymogenów, zwanych równieŜ
pro-kaspazami. Pro-kaspazy składają się z C–końcowej domeny katalitycznej
złoŜonej z dwóch podjednostek – duŜej (ok. 20 kDa) i małej (ok. 10 kDa),
połączonych krótkim „łącznikiem” oraz z N-końcowej tzw. prodomeny, czyli
polipeptydu o róŜnej długości. Kaspaza-1, 4, 5, 11 i 12 wydają się być głównie
związane z proteolityczną obróbką cytokin prozapalnych pro-IL-1β i pro-IL-18 a ich
rola w przebiegu apoptozy jest kwestionowana. Pozostałe uczestniczą w szlakach
indukcji oraz egzekucji apoptozy i na tej podstawie moŜna je podzielić na: kaspazy
inicjujące – kaspaza-2, 8, 9, 10 i 12 oraz kaspazy efektorowe – kaspaza-3, 6 i 7.
Kaspazy inicjujące posiadają długie prodomeny zawierające „domeny efektorowe
śmierci” – DED (ang.
death effector domain
) (prokaspaza-8 i -10) lub „domeny
rekrutujące kaspazy” – CARD (ang.
caspase and RIP adaptor with a death domain
)
(prokaspaza-9 i prokaspaza-2).
W odpowiedzi na związanie receptorów śmierci (
szlak zewn
ę
trzny
), bądź
w odpowiedzi na sygnały pochodzące z wnętrza komórki (
szlak wewn
ę
trzny
),
kaspazy inicjujące są poprzez swoje prodomeny przyłączane i aktywowane
w następstwie dimeryzacji w wielobiałkowych kompleksach: DISC (ang.
death-
inducing signaling complex
) dla szlaku zewnętrznego i apoptosomie dla szlaku
wewnętrznego. W przeciwieństwie do nich, kaspazy efektorowe, występujące
w formie nieaktywnych dimerów, są aktywowane na drodze proteolizy przez
uprzednio zaktywowane kaspazy inicjujące. Kaspazy efektorowe i niektóre inicjujące
mogą być równieŜ aktywowane bezpośrednio przez granzym B (tzw. aktywacja
trans) uwalniany w trakcie reakcji cytotoksycznej zaleŜnej od limfocytów T lub
komórek NK.
Po aktywacji, kaspazy efektorowe uczestniczą w proteolitycznej destrukcji
komórki. Kluczową kaspazą, zaangaŜowaną praktycznie w kaŜdą zbadaną formę
apoptozy jest efektorowa kaspaza 3. Dotychczas opisano około 60 białek, będących
substratami kaspaz i ich lista wciąŜ rośnie. Jednym z pierwszych zidentyfikowanych
substratów kaspazy-3 była polimeraza PARP (ang.
poly-(ADP-ribose) polymerase
).
Głównymi substratami kaspaz są białka regulujące metabolizm DNA podczas
procesu apoptozy. Do grupy tej naleŜy m.in. kompleks DN-azy aktywowany przez
kaspazy – DFF (ang.
DNA fragmentation factor
). Kompleks ten jest złoŜony z
właściwego enzymu DN-azy aktywowanej przez kaspazy – CAD (ang.
caspase
activated DN-ase
) oraz jej inhibitora ICAD. W normalnych komórkach CAD jest
zintegrowana z ICAD i pozostaje nieaktywna. W trakcie apoptozy, ICAD jest
uwalniany z kompleksu DFF przy udziale kaspazy-3 i -7, powodując aktywację CAD
i degradację DNA. Substratem dla kaspaz efektorowych jest m.in. aktyna, a jej
degradacja jest powodem charakterystycznych zmian morfologii komórek
apoptotycznych.
Szlak zewn
ę
trzny apoptozy
zostaje zainicjowany przez związanie ligandu
z receptorem śmierci na powierzchni komórki.
Receptory
ś
mierci i ich ligandy
naleŜą do nadrodziny receptorów dla czynnika martwicy nowotworów - TNFR (ang.
tumor necrosis factor receptors
). Obecnie nadrodzina TNFR obejmuje 32 receptory
(m.in. TNFR-1, TNFR-2, Fas/CD95, CD40, TRAIL-R1, TRAIL-R2) i 19 ligandów
(m.in. TNF
a
, FasL/CD95L, CD40L, TRAIL). Receptory śmierci są białkami
transbłonowymi o znacznej homologii w części zewnątrzbłonowej i znacznie mniej
zaznaczonej w części cytoplazmatycznej. Na część zewnętrzną składa się od 3 do 6
domen bogatych w cysteinę, które uczestniczą w rozpoznawaniu odpowiednich
ligandów. W podbłonowych, cytoplazmatycznych fragmentach receptorów z rodziny
[ Pobierz całość w formacie PDF ]